內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞的信號在血管形成的時(shí)候是至關(guān)重要的。其中，外分泌體就是其中一種通信方式。有研究發(fā)現(xiàn)，外分泌體在免疫應(yīng)答，腫瘤存活，應(yīng)激反應(yīng)和血管生成上的細(xì)胞間通信有著非常重要的作用。在外分泌體中有mRNA和miRNA往往會對受體細(xì)胞產(chǎn)生影響。荷蘭的研究人員對外分泌體內(nèi)的microRNA miR-214的研究發(fā)現(xiàn)，含有miR-214的外分泌體能夠抑制受體細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，并且促進(jìn)血管生成的發(fā)生。與此同時(shí)，其還會抑制毛細(xì)血管失調(diào)癥突變體 ataxia angiectasia mutated (ATM)的表達(dá)。

研究人員采用毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞系（he human microvascular endothelial cell line (HMEC-1)），鋪在基質(zhì)膠上，采用添加/無外分泌體的培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，對比不同條件下的小管長度。

Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells

B. van Balkom, O. De Jong, M. Smits, J. Brummelman, K. den Ouden, P. de Bree, M. van Eijndhoven, D. Peg, W. Stoorvogel and T. Würdinger

Blood, 2013, 10.1182/blood-2013-02-478925

（一）實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

1）細(xì)胞：  HMEC-1 (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)    104 per well

2）培養(yǎng)基：      MCDB 131 Medium (Life Technologies)

3）基質(zhì)膠：      Matrigel (ECMatrix, Millipore)                           10 µl per well

4）耗材：        µ-Slide Angiogenesis, ibiTreat (ibidi, 81506)                1 Slide

5）其他：        細(xì)格紙                                             1 sheet 

實(shí)驗(yàn)流程圖：

實(shí)驗(yàn)流程圖，提前將Matrigel融化，鋪于ibidi血管生成載玻片 µSlide Angiogenesis 的下孔中，待膠凝后，將細(xì)胞懸液加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀察。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

1）準(zhǔn)備基質(zhì)膠

①　實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過第二天緩慢融化。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4。C預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）

②　開始實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。

③　打開滅菌包裝，取出ibidi血光生成載玻片 µ-Slide Angiogenesis。

④　每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

怎么知道加了合適體積的Matrigel：
由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。這時(shí)用一張格子紙就能知道移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

2）凝膠

①　蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

②　準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。

③　將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。

④　將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。

⑤　等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

3）鋪細(xì)胞

加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在正式實(shí)驗(yàn)開始之前，要對不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得佳比例的細(xì)胞密度。使用HMEC-1細(xì)胞，每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。

①　準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液，充分混勻。

②　將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。

③　每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。

④　同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。

⑤　蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

4）不同培養(yǎng)基處理

采用無處理基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basal,-），培養(yǎng)了HMEC-124小時(shí)后收集的培養(yǎng)基（cond,comp.）和在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入了分離出來的外分泌體的培養(yǎng)基（basal,+)分別加入血管生成載玻片中，37℃，培養(yǎng)18小時(shí)。

5）采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果

可以按照細(xì)胞的生長速度定時(shí)采集圖像，并且對其成管長度測量和記錄，并且對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果可見，18小時(shí)后，分別測量3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的血管長度，統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，加入外分泌體的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)HMEC-1細(xì)胞24小時(shí)后收集的培養(yǎng)基的成管長度，顯著長于純的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的HMEC-1細(xì)胞的成管長度。說明，外分泌體對血管生成有著顯著的促進(jìn)作用。